當(dāng)在內(nèi)皮細(xì)胞上接種到類似基底膜的表面時(shí)，它們?cè)隗w外形成類似毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu)，再現(xiàn)了血管生成的過(guò)程。這種管形成實(shí)驗(yàn)被用作血管生成的體外模型系統(tǒng)，以研究特定物質(zhì)的促血管生成或抗血管生成效果。
Matrigel®是從Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提取的，并作為標(biāo)準(zhǔn)的基底膜樣（BM）表面。然而，Matrigel®的一個(gè)缺點(diǎn)是其多種BM蛋白的成分定義不清且可變。這導(dǎo)致不同批次之間的機(jī)械和生化性質(zhì)波動(dòng)，阻礙了可靠的重現(xiàn)性和可比性。
µ-Slide 15 Well 3D的示意圖。ibidi 的“孔中孔” 技術(shù)避免了凝膠彎液面的形成，從而形成了一個(gè)平坦的細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域.
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用描述了一種使用層粘連蛋白-I型膠原凝膠（代替Matrigel®）在µ-Slide 15 Well 3D中進(jìn)行管形成試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方案。這種定義明確的雙組分層粘連蛋白-I型膠原凝膠能夠可靠地重復(fù)形成類似毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu)，可以作為Matrigel®的替代品。本應(yīng)用不討論凝膠之間差異的詳細(xì)分析。欲了解更多信息，請(qǐng)閱讀相關(guān)文件和文獻(xiàn)。
相關(guān)文獻(xiàn)：
•Rüdiger D, Kick K, Goychuk A, et al. Cell-Based Strain Remodeling of a Nonfibrous Matrix as an Organizing Principle for Vasculogenesis. Cell Rep.2020 Aug 11; 32(6):108015.doi:10.1016/j.celrep.2020.108015.
1、材料
1.1.試劑和緩沖液
• 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC, C-12203, PromoCell）
• 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基（C-22010, PromoCell）
• Collagen I, Rat Tail, 非胃蛋白酶化，5 mg/ml（50201, ibidi）
• Collagen I, Bovine, 非胃蛋白酶化，5 mg/ml（50301, ibidi）
• Cultrex 3-D 培養(yǎng)基質(zhì)層粘連蛋白I 6 mg/ml（3446-005-01, R&D Systems）
• 10x PBS（70011-044, Gibco）
• NaOH在超純水中，1.25 M和7 M
• 乙酸，0.1 M和17.5 mM
1.2.設(shè)備
• µ-Slide 15 Well 3D, ibiTreat（81506, ibidi）
• µ-Slide Rack 載玻片支架（80003, ibidi）
• 用于檢查凝膠體積的刻度紙
• 冰和冷卻架
• 標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備（移液器、試管、無(wú)菌工作臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、血球計(jì)數(shù)器等）
• 倒置顯微鏡
• 可選：多通道移液器
2.制備3D凝膠
在無(wú)菌條件下執(zhí)行以下所有實(shí)驗(yàn)步驟。
可以使用Collagen Type I, Rat Tail 或 Collagen Type I, Bovine來(lái)制備層粘連蛋白-I型膠原凝膠。對(duì)于兩者，首先必須制備4 mg/ml的I型膠原凝膠（見(jiàn)2.1）。
關(guān)于移液凝膠的重要注意事項(xiàng)
始終使用預(yù)冷的吸頭（4°C）來(lái)移液凝膠。
由于層粘連蛋白和I型膠原的高粘度，建議在所有涉及層粘連蛋白和I型膠原的步驟中使用反向移液。將移液管壓至第二個(gè)壓力點(diǎn)并完全填充吸頭。只在達(dá)到第一個(gè)壓力點(diǎn)時(shí)才分配凝膠。這會(huì)在吸頭中留下一定量的凝膠殘余物，但體積更準(zhǔn)確。或者，您可以使用專為高粘度溶液設(shè)計(jì)的移液管。我們推薦使用Eppendorf Visco Tips或Gilson Microman E等產(chǎn)品。
請(qǐng)注意，即使在4°C下，凝膠混合物至多只能在部分凝膠化前使用5分鐘。
1.實(shí)驗(yàn)前一天，將層粘連蛋白放在冰箱中的冰上于4°C緩慢解凍過(guò)夜。按照說(shuō)明書(shū)制備I型膠原。
2.在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將所有用于凝膠的材料和足夠容量的無(wú)菌管放入層流罩內(nèi)的冷卻架上。在制備凝膠期間，始終將材料和凝膠放在在冷卻架上。
2.1.制備I型膠原凝膠
關(guān)于I型膠原濃度的重要說(shuō)明
由于批次特定的偏差，瓶中的I型膠原蛋白濃度可能會(huì)有所不同。
在制備工作溶液4 mg/ml之前，將I型膠原調(diào)整為4.5 mg/ml的儲(chǔ)備溶液。
在CoAtab的I型膠原蛋白產(chǎn)品頁(yè)面上查看單個(gè)批次特定膠原蛋白濃度的分析證書(shū)（CoA）。
1.稀釋前，必須通過(guò)上下移液幾次積極混合瓶中的原始I型膠原凝膠。這確保創(chuàng)建了均勻的溶液。
制備I型膠原儲(chǔ)備溶液
2.將I型膠原稀釋至4.5 mg/ml。對(duì)于Collagen Type I, Rat Tail，使用17.5 mM乙酸，對(duì)于Collagen Type I, Bovine，使用0.1 M乙酸。在分析證書(shū)（CoA）中找到單個(gè)批次特定的I型膠原蛋白濃度。
制備4 mg/ml I型膠原工作溶液
3.按照下表中列出的順序，將所有成分（除了I型膠原）移液到一個(gè)預(yù)冷的管中。在保持管子在冷卻架中的同時(shí)徹底混合。
4.將膠原儲(chǔ)備溶液加入混合物中，得到工作溶液為4 mg/ml。在保持管子在冷卻架中的同 時(shí)，通過(guò)移液徹底混合。
使用預(yù)稀釋的4.5 mg/ml Collagen I, Rat Tail （左側(cè)）或Collagen I, Bovine （右側(cè)）的儲(chǔ)備溶液，配制4 mg/ml Collagen I工作溶液的移液方案。請(qǐng)注意，為了正確設(shè)置pH值，對(duì)于Collagen I, Rat Tail（左側(cè)）使用1.25 M NaOH溶液，而對(duì)于Collagen I, Bovine （右側(cè)）使用7 M NaOH溶液。所有成分按移液順序列出。濃度的差異用藍(lán)色突出顯示。
2.2.制備層粘連蛋白-I型膠原凝膠
1.層粘連蛋白與I型膠原的混合比例為4:1（例如，將400 µl層粘連蛋白與100 µl I型膠原工作溶液混合）。
2.在保持管子在冷卻架中的同時(shí)，通過(guò)移液徹底混合。現(xiàn)在凝膠已準(zhǔn)備好可以移液到µ-Slide 15 Well 3D的內(nèi)孔中（見(jiàn)2.3）。
2.3.凝膠應(yīng)用
1.在層流罩中放置一個(gè)µ-Slide支架。從無(wú)菌包裝中取出µ-Slide 15 Well 3D并將其放在µ-Slide支架上。
2.在µ-Slide下方的罩子中放入一張刻度紙以調(diào)整體積。確保載玻片和刻度紙之間的距離約為1-2厘米。
3.始終使用預(yù)冷的吸頭（4°C）來(lái)移液凝膠。
4.為了避免凝膠中出現(xiàn)氣泡，請(qǐng)確保在填充到孔中之前凝膠溶液已經(jīng)充分混合。因此，在將吸頭留在凝膠中時(shí)，用移液器（10 µl）進(jìn)行三次上下移動(dòng)。
5.向µ-Slide 15 Well 3D的每個(gè)內(nèi)孔加入10 µl的凝膠。將移液器吸頭直立保持在孔的中間，以防止凝膠泄漏到上部孔中。
6.用蓋子蓋住µ-Slide載玻片。
µ-Slide 15 Well 3D 放在帶有刻度紙的µ-Slide支架上，用于調(diào)整凝膠體積。
調(diào)整凝膠體積
無(wú)凹凸的凝膠表面對(duì)于出色成像至關(guān)重要。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，每個(gè)內(nèi)孔的凝膠體積必須精確為10 µl。由于凝膠的高粘度，可能需要將移液器調(diào)整到大于或小于10 µl。
要準(zhǔn)確調(diào)整凝膠體積，請(qǐng)將載玻片放在µ-Slide支架中的刻度紙上方1-2厘米處。現(xiàn)在將移液器調(diào)至10 µl并將凝膠填充到一個(gè)內(nèi)孔中。通過(guò)填充的孔觀察紙上的標(biāo)記。如果可以看到放大或縮小效應(yīng)，則以±1 µl的步驟改變體積，直到你不再觀察到放大效應(yīng)為止。
如果刻度紙的網(wǎng)格看起來(lái)較小，則必須增加移液量。如果網(wǎng)格放大了，則必須減少移液量。
凝膠體積不足會(huì)導(dǎo)致刻度紙網(wǎng)格的外觀變小，而過(guò)量的凝膠體積則會(huì)使刻度紙網(wǎng)格的外觀增大。
2.4.凝膠化
1.準(zhǔn)備一個(gè)浸有水的紙巾的培養(yǎng)皿作為濕度室。2. 將µ-Side放入培養(yǎng)皿中并蓋上蓋子。
3.為了聚合，將整個(gè)組件放入培養(yǎng)箱中60分鐘。
4.同時(shí)，準(zhǔn)備細(xì)胞懸浮液（見(jiàn)3）。
µ-Slide 15 Well 3D 在濕度室中進(jìn)行凝膠聚合。
3.細(xì)胞接種
凝膠表面接種的細(xì)胞數(shù)量是獲得管形成測(cè)定可靠結(jié)果的關(guān)鍵參數(shù)。細(xì)胞數(shù)量的偏差會(huì)強(qiáng)烈影響管狀網(wǎng)絡(luò)的形成。細(xì)胞類型和大小決定了細(xì)胞接種數(shù)量，并且在開(kāi)始一系列實(shí)驗(yàn)之前必須進(jìn)行優(yōu)化。HUVEC應(yīng)使用低代數(shù)（至多到P6）。
在整個(gè)操作過(guò)程中迅速工作以防止孔干燥是非常重要的。除非另有說(shuō)明，否則所有給出的體積均為每個(gè)孔體積，所有孵育步驟均在室溫下進(jìn)行。
1.收獲HUVEC，離心，并在少量的培養(yǎng)基中稀釋細(xì)胞沉淀（取決于所需的細(xì)胞濃度）以進(jìn)行計(jì)數(shù)。
2.計(jì)數(shù)細(xì)胞。計(jì)數(shù)應(yīng)盡可能準(zhǔn)確，并且始終以相同的方式執(zhí)行，以便在所有孔中都有相同數(shù)量的細(xì)胞。對(duì)于每個(gè)孔5000個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)，調(diào)整它們?cè)谂囵B(yǎng)基中的濃度為1 x 105個(gè)細(xì)胞/ml。
3.從培養(yǎng)箱中取出裝有聚合凝膠的µ-Slide 15 Well 3D，并將其放在層流罩下的µ-Slide支架上。
4.在將細(xì)胞懸浮液加入孔中之前，通過(guò)多次上下移液徹底混合。向每個(gè)上部孔加入50 µl。保持移液器吸頭直立，不要用移液器吸頭觸碰凝膠。在此步驟中使用多通道移液器可能很有幫助。
5.用提供的蓋子蓋住µ-Slide。可選地，可以使用ibiSeal 22 x 48(10872)，一種自粘性蓋膜，覆蓋孔以改善相差顯微鏡觀察
6.µ-Slide 15 Well 3D現(xiàn)在已經(jīng)準(zhǔn)備好進(jìn)行觀察。細(xì)胞將通過(guò)被動(dòng)沉降過(guò)程沉積到凝膠表面頂部。隨后，管形成開(kāi)始，可以在一個(gè)焦平面上成像且無(wú)彎液面。
使用多通道移液器將細(xì)胞移入µ-Slide 15 Well 3D中
(A) 細(xì)胞的被動(dòng)沉降過(guò)程。幾分鐘后，所有細(xì)胞都位于底部。
(B) µ-Slide 15 Well 3D中管形成的示意圖（僅顯示了凝膠上帶有細(xì)胞的內(nèi)孔）。
4.圖像采集
管形成可以使用明場(chǎng)、相差或熒光顯微鏡成像（例如，使用活細(xì)胞染料如鈣黃綠素染色時(shí)）。
顯微鏡上的數(shù)據(jù)采集可以手動(dòng)或自動(dòng)進(jìn)行。特別是當(dāng)首次進(jìn)行管形成測(cè)定實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們建議通過(guò)錄制延時(shí)視頻來(lái)自動(dòng)采集數(shù)據(jù)，以確定時(shí)間依賴性和曲線特征（例如，較大值和穩(wěn)定相位）。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，單次手動(dòng)測(cè)量通常足以研究物質(zhì)對(duì)管形成的影響。
對(duì)于HUVECs，我們建議使用4倍或10倍放大，并在至少5小時(shí)內(nèi)每5分鐘拍攝一次單個(gè)幀。為了量化管形成，可以根據(jù)不同的參數(shù)分析圖像，如管長(zhǎng)度、環(huán)路、細(xì)胞覆蓋面積或分支點(diǎn)。
5.結(jié)果
大鼠尾部和牛層粘連蛋白-I型膠原凝膠均能誘導(dǎo)管狀網(wǎng)絡(luò)的形成。2小時(shí)后，管、環(huán)和分支點(diǎn)將可見(jiàn)。與Matrigel®相比，網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和網(wǎng)絡(luò)形成的動(dòng)態(tài)有所不同。本應(yīng)用說(shuō)明中不討論凝膠之間的差異及其原因的進(jìn)一步詳細(xì)分析。然而，兩種凝膠都可以用來(lái)研究特定物質(zhì)的促血管生成或抗血管生成作用對(duì)管形成網(wǎng)絡(luò)可檢測(cè)關(guān)鍵參數(shù)的影響。
µ-Slide 15 Well 3D中使用HUVECs進(jìn)行管形成測(cè)定的延時(shí)圖像。在Matrigel®（左側(cè)）、層粘連蛋白-I型膠原大鼠尾部凝膠（中間）和層粘連蛋白-I型膠原牛凝膠（右側(cè)）上，接種細(xì)胞0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)和24小時(shí)后的相差顯微鏡觀察，使用4倍物鏡。
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