在侵襲實驗中，長時間追蹤熒光標記的細胞對于研究細胞群體的遷移行為非常有益。當使用不表達報告染料的天然細胞系時，必須對細胞進行瞬時標記。然而，許多瞬時染料會影響細胞行為，并且只適用于短期顯微鏡成像，因為它們的強度會因降解、光漂白或細胞分裂而降低。超亮熒光納米顆粒提供了一種很有前景的新方法。經過幾個小時的短暫孵育期后，細胞會被生物相容且無毒的熒光納米顆粒包裹，并可以連續成像以進行縱向研究。
在本應用說明中，兩種不同的細胞系用Cellaris™熒光納米顆粒(Luminicell)標記，然后接種在2孔插件共聚焦皿中(ibidi，81176)進行2D侵襲實驗。移除2孔插件(Culture-Insert 2 Well)后，熒光標記有助于區分兩種細胞群體的遷移行為。
在ibidi 2孔插件共聚焦皿中生長的MCF-7細胞(Cellaris™ 670.紅色)和NIH-3T3細胞(Cellaris™ 540.綠色)的共培養
ibidi雙細胞共培養侵襲實驗新方案
1 材料
1.1 試劑和緩沖液
Cellaris™ 540 - 細胞標記試劑盒(綠色)和Cellaris™ 670 - 細胞標記試劑盒(紅色)，(Luminicell)
MCF-7細胞系(乳腺癌，人)和NIH-3T3細胞系(成纖維細胞，小鼠)
細胞培養基：RPMI-1640(Gibco,21845034)，補充10%胎牛血清(Gibco;10270106)
標準細胞培養試劑(PBS、胰蛋白酶/EDTA)
1.2 設備
• 預置2孔插件的共聚焦皿(Culture-Insert 2 Well in µ-Dish 35 mm)(ibidi，81176)
• 標準細胞培養設備(無菌工作臺、細胞培養箱、培養瓶、移液器、搶頭等)
• 鑷子
• 配備FITC和Cy5 HC濾光片組(Nikon)的Nikon TI顯微鏡、4x CFI PlanFluor DL物鏡(Nikon)、LED Sola Light Engine (lumencor)、ORCA-Flash 4.0-LT相機(Hamamatsu Photonics)
• ibidi載物臺培養箱載玻片/培養皿，CO2/O2–銀色系列(Stage Top Incubator Slide/Dish, CO2/O2–Silver Line(ibidi，12722))
2 準備
2.1 使用Cellaris™細胞標記試劑盒標記細胞
• 在T25細胞培養瓶(或其他細胞培養實驗室器皿)中培養細胞至80-90%匯合。
• 通過將Cellaris™納米顆粒在5ml補充細胞培養基中稀釋至2nM(100倍)，分別制備染色溶液。
• 用制備好的染色溶液替換細胞培養瓶中的舊培養基，并在細胞培養箱中孵育1-24小時，具體時間根據細胞類型而定。此處，我們將MCF-7細胞用Cellaris™ 670染色，將NIH-3T3細胞用Cellaris™ 540 染色，持續2-4小時。
2.2 在Culture-Insert 2 Well中設置傷口愈合實驗
• 染色后，按常規方法收集細胞。包括離心步驟以去除細胞碎片和游離納米顆粒。
• 根據細胞類型，準備3-7×105個細胞/ml的細胞懸液。對于MCF-7和NIH-3T3.使用3×105個細胞/ml的細胞濃度，可在24小時內形成匯合的細胞層。
• 在無菌工作臺中取出帶有Culture-Insert 2 Well的µ-Dish。
• 在一個孔中加入70µl MCF-7懸液，在Culture-Insert的第二個孔中加入70µl NIH-3T3懸液。讓細胞沉降5-10分鐘，避免搖晃，因為這會導致細胞分布不均勻。
• 將帶有Culture Insert的µ-Dish放入濕潤的腔室(例如，帶有濕紙巾的培養皿)中，然后放入細胞培養箱中。在37°C和5%CO2下孵育24小時或直到細胞層匯合。
• 將µ-Dish放入無菌工作臺上，用無菌鑷子夾住Culture-Insert 2 Well的一角，輕輕移除Culture-Insert 2 Well。
• 向µ-Dish中加入2 ml補充的細胞培養基。如有必要，可進行洗滌步驟以去除未貼壁細胞或細胞碎片。
• 用蓋子蓋住µ-Dish。此時，樣品已準備就緒，可進行鏡檢成像。
圖1.Culture-Insert 2 Well實驗流程
2.3 活細胞熒光顯微成像
• 提前預熱顯微鏡的孵育系統(如ibidi Stage Top Incubator)(在實驗前至少0.5-2小時)。在37°C、5%CO2和80%濕度下進行實驗。
• 將樣品放置在顯微鏡載物臺上的孵育腔內，并使用4倍物鏡聚焦細胞層。
• 實驗設置：每20分鐘采集一次傷口區域的相差、FITC(Cellaris™ 540)和Cy5(Cellaris™ 670)通道圖像。確保在圖像采集間隔期間關閉照明光源。
1)Cellaris™ 540可用紫/藍光源激發(Ex 423nm，Em 540nm)。
2)Cellaris™ 670可用藍/綠光源激發(Ex 506nm，Em 670nm)。
重要提示：為減少光照對細胞造成的應激，建議降低激發光源的照明強度，例如在中性密度濾光片(ND4. ND8)插入光路中。
• 監測細胞行為24-72小時。使用合適的圖像分析軟件(例如ImageJ(NIH))處理和評估延時圖像。
3 結果
染色過程有效地將納米顆粒整合到細胞中，而對細胞活力沒有明顯的adverse effects(不良影響).Cellaris™為延時顯微鏡提供了清晰且可區分的熒光信號。Culture-Insert 2 Well能夠創建一個清晰的劃痕間隙，從而可以精確追蹤兩種單獨標記的細胞群體的細胞遷移和行為隨時間的變化，如圖2所示。在活細胞成像條件下實時觀察細胞運動，可為劃痕愈合的動態提供有價值的見解，這在圖2中清晰可見。
圖2.MCF-7細胞(Cellaris™ 670.紅色)和NIH-3T3細胞(Cellaris™ 540.綠色)的延時圖像顯示了各自細胞系的遷移以及初始500µm寬的劃痕間隙的閉合。黃線標記間隙的中線。MCF-7細胞遷移得更快，并在36小時內閉合了間隙。比例尺= 100µm
相差和熒光成像的結合能夠可視化標記的均勻性。圖3顯示，顆粒不僅在一個細胞內是均勻的，而且在整個細胞層上也是均勻的。此外，正如白色箭頭所指示的那樣，當兩個細胞前沿融合時，似乎沒有兩個細胞之間的交叉標記。這一證據表明，即使在長期活細胞研究中，Cellaris™在多色實驗中也不會表現出串擾效應。
圖3.在實驗開始90小時后拍攝的MCF-7(Cellaris™ 670.紅色)和NIH-3T3(Cellaris™ 540.綠色)融合圖像的細節圖。左側圖像中箭頭顯示細胞侵入另一個群體。右側圖像顯示相同區域的相差圖像。比例尺=100µm
本研究旨在探索使用一種簡單但有效的標記方法進行共培養和遷移研究。使用Cellaris™細胞標記試劑盒成功標記了MCF-7和NIH-3T3細胞，隨后將其用于與Culture-Insert 2 Well劃痕插件進行的細胞侵襲劃痕實驗。Cellaris™細胞標記試劑盒和Culture-Insert 2 Well劃痕插件的易用性，使得實驗操作簡便，并能獲得可靠且可重現的結果。
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