ibidi為腫瘤相關(guān)研究提供解決方案！
德國(guó)易必迪ibidi公司成立于2001年，位于馬丁雷德，鄰近慕尼黑。公司自成立以來，專注于細(xì)胞培養(yǎng)及功能實(shí)驗(yàn)的耗材及儀器開發(fā)（見圖1），致力于為科研工作者提供操作簡(jiǎn)單、能夠快速獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果的高品質(zhì)產(chǎn)品，在美國(guó)及歐美生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域收到歡迎，在國(guó)內(nèi)，ibidi產(chǎn)品設(shè)計(jì)及其優(yōu)良的產(chǎn)品性能也使其逐漸獲得相關(guān)科研工作者的關(guān)注與信賴。
圖1. ibidi部分產(chǎn)品展示
利用易必迪公司ibidi提供的系列產(chǎn)品，可以從細(xì)胞和分子水平上對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移等過程進(jìn)行研究。下面以研究P蛋白在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用為例，探討ibidi公司系列產(chǎn)品從免疫熒光檢測(cè)，到功能實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移及血管生成等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的生物學(xué)行為中的應(yīng)用。
P蛋白在結(jié)腸癌病人中高表達(dá)，并且與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。對(duì)于可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起作用的特定蛋白分子，通過免疫熒光技術(shù)檢測(cè)其細(xì)胞內(nèi)表達(dá)及定位，通常是研究的第一步。P蛋白是一個(gè)功能未知的新蛋白，我們首先制備了分別針對(duì)N端、C端及多個(gè)功能域的抗體，通過Western blotting和免疫熒光實(shí)驗(yàn)來確定其表達(dá)及在細(xì)胞內(nèi)的具體定位（圖2）。由于ibidi的m-slide所需細(xì)胞數(shù)、抗體量等都非常少，同時(shí)可以很方便地在同一片slide上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、固定、染色等操作（見圖2A），我們同批次在多個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系中，利用自己制備的5個(gè)針對(duì)不同區(qū)域的抗體檢測(cè)了P蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)及定位，發(fā)現(xiàn)P蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞系中普遍高表達(dá)，主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞核周圍有聚集，核內(nèi)也有少量信號(hào)（見圖2B）。
圖2. 蛋白P的細(xì)胞內(nèi)定位。 A）實(shí)驗(yàn)流程示意圖。將結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco2按9000個(gè)細(xì)胞/孔的密度種植在ibidi的m-slide中，培養(yǎng)兩天后，在m-slide中直接固定細(xì)胞，孵育一抗（抗P蛋白）和熒光二抗，封片后在共聚焦顯微鏡下觀察。B）利用針對(duì)P蛋白不同區(qū)域的多種抗體進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，均提示內(nèi)源P蛋白特異性地定位在細(xì)胞質(zhì)。右邊的免疫熒光圖紅色熒光顯示的是P蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位，綠色熒光（Na-K-ATPase）顯示的是細(xì)胞膜，藍(lán)色熒光（DAPI）顯示的是細(xì)胞核。
為了進(jìn)一步了解P蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能的作用，我們一方面通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抑制P蛋白對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用siRNA 降低P蛋白的表達(dá)顯著抑制Caco2細(xì)胞的增殖，而且這種抑制作用可以被外源表達(dá)的RNAi resistant 的P蛋白所挽救（rescue）。另一方面利用經(jīng)典的傷口愈合實(shí)驗(yàn)（也稱劃痕實(shí)驗(yàn)）我們檢測(cè)了P蛋白的表達(dá)水平是否對(duì)細(xì)胞遷移有影響（圖3）。我們選用ibidi culture-insert產(chǎn)品代替?zhèn)鹘y(tǒng)的槍頭劃痕方法，主要是基于ibidi生物相容性硅膠制成的插件，可產(chǎn)生確定的500μm “劃痕”區(qū)域，“劃痕”區(qū)域規(guī)整，配合配套的軟件分析方便獲得可靠的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，而且增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性（圖3A）。我們選擇了在17小時(shí)之內(nèi)的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞的遷移情況。發(fā)現(xiàn)P蛋白的缺失對(duì)細(xì)胞遷移有明顯抑制作用（圖3B-C）。
圖3. P蛋白的缺失抑制了Caco2細(xì)胞的遷移。A）愈傷實(shí)驗(yàn)流程示意圖。易必迪公司設(shè)計(jì)提供的愈傷實(shí)驗(yàn)體系，有標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)流程和細(xì)胞培養(yǎng)器材：將5X104細(xì)胞種植在被culture-insert（Ibidi）分開的小室中，等細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿后，去除culture-insert，讓細(xì)胞自由爬過中間的“cell free gap”（約500mm），在不同時(shí)間點(diǎn)鏡下觀察愈傷過程。B）顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，RNAi P蛋白明顯抑制細(xì)胞的遷移，細(xì)胞層的愈傷過程受到嚴(yán)重影響。C）B圖的定量分析顯示，17小時(shí)后，對(duì)照組細(xì)胞層已經(jīng)愈合超過90%，而P蛋白RNAi的細(xì)胞覆蓋的傷口面積僅為對(duì)照組細(xì)胞的30%。
腫瘤細(xì)胞向局部侵犯或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤重要的特性之一。我們利用ibidi可視化的“transwell”--ibipore 產(chǎn)品（見圖4A）檢測(cè)了P蛋白對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲的影響。ibipore產(chǎn)品有上下兩個(gè)獨(dú)立的通道（見圖4B），兩個(gè)通道overlap的區(qū)域由一個(gè)孔徑大小均一的玻璃網(wǎng)篩隔離開（見圖4C）。兩個(gè)通道可以分別培養(yǎng)細(xì)胞，通過兩種方式，細(xì)胞可以貼壁于玻璃網(wǎng)篩的上下兩側(cè)。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中（見圖4D），ibipore考慮到這一因素，采用兩側(cè)可以培養(yǎng)細(xì)胞的玻璃網(wǎng)篩的設(shè)計(jì)，可以檢測(cè)細(xì)胞向上側(cè)通道進(jìn)行遷移的能力，進(jìn)而巧妙的排除了重力作用對(duì)侵襲實(shí)驗(yàn)的影響，而且光學(xué)成像特性好，可以實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的侵襲情況。配合ibidi流體剪切力系統(tǒng)以及加熱孵育系統(tǒng)，可以在流動(dòng)、剪切力條件下實(shí)時(shí)的觀察細(xì)胞的侵襲以及遷移等實(shí)驗(yàn)。我們采用ibipore產(chǎn)品實(shí)時(shí)觀察腫瘤細(xì)胞向上側(cè)小室侵襲的情況，發(fā)現(xiàn)P蛋白Knockdown的細(xì)胞向上側(cè)侵襲的能力顯著低于野生型細(xì)胞（數(shù)據(jù)未展示）。
圖4.可視化的細(xì)胞侵襲產(chǎn)品—ibipore。A）ibipore及ibipore玻璃膜培養(yǎng)細(xì)胞的染色結(jié)果。圖片背景為在ibipore玻璃膜上培養(yǎng)細(xì)胞的熒光染色結(jié)果，規(guī)則排布的白色圓點(diǎn)為玻璃膜的孔隙。B）ibipore組成示意圖，上下兩個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞培養(yǎng)通道，中間overlap區(qū)域由孔徑大小均一的玻璃網(wǎng)篩隔離開。C）3μm孔徑玻璃網(wǎng)篩。D）細(xì)胞侵襲應(yīng)用舉例。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證P蛋白在腸癌的惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用，我們構(gòu)建了P蛋白被穩(wěn)定敲除的HCT-116細(xì)胞。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，P蛋白表達(dá)被抑制后，HCT-116的裸鼠成瘤能力受到非常顯著的抑制。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示P蛋白的表達(dá)與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的相關(guān)性。為了尋找其分子機(jī)理，我們通過microarray的方法檢測(cè)P蛋白knockdown引起基因表達(dá)譜的變化，從而尋找P蛋白可能參與調(diào)控的下游基因。非常有意思的是，我們發(fā)現(xiàn)P蛋白影響了一系列與增殖、趨化及血管生成相關(guān)的基因。我們選擇了改變顯著，同時(shí)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的CXCR4和VEGF-A兩個(gè)分子進(jìn)一步驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細(xì)胞中抑制P蛋白的表達(dá)，會(huì)明顯降低這兩個(gè)分子在mRNA及蛋白水平的表達(dá)。
CXCR4是趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（CXCL12）的特異受體，有報(bào)道稱其與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。由于P蛋白在結(jié)腸癌病人中與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，我們推測(cè)P蛋白可能通過調(diào)節(jié)CXCR4的表達(dá)而影響結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移，因而通過趨化實(shí)驗(yàn)比較了P蛋白被敲除的CaCo2細(xì)胞及相應(yīng)對(duì)照組細(xì)胞在CXCL12刺激下的遷移情況（圖5）。我們利用ibidi chemotaxis3D進(jìn)行了細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。ibidi chemotaxis3D可以進(jìn)行2D或者3D的細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)（將細(xì)胞種入圖5A“1”區(qū)域），在“2”“3”小室直接加入含有趨化因子的培養(yǎng)液，或者直接種入細(xì)胞，以研究細(xì)胞分泌物對(duì)“1”區(qū)域細(xì)胞的影響。1張板上3個(gè)chambers的設(shè)計(jì)方便同時(shí)進(jìn)行并行的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，一次獲得實(shí)驗(yàn)所需的所有結(jié)果（圖5B）。配合ibidi的活細(xì)胞加熱孵育系統(tǒng)監(jiān)測(cè)（圖5C），可以進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)基成像。ibidi加熱孵育系統(tǒng)獨(dú)特的頂蓋玻璃蓋加熱設(shè)計(jì)，使溫度高于平板，在頂蓋和培養(yǎng)板之間形成垂直溫度梯度，有效避免培養(yǎng)液蒸發(fā)而影響細(xì)胞培養(yǎng)條件，以及培養(yǎng)皿蓋冷凝而影響顯微成像質(zhì)量等問題。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組Caco2細(xì)胞向含有CXCL12的小室方向遷移（圖5D），而P蛋白敲除的CaCo2細(xì)胞則向兩邊隨機(jī)遷移（圖5E）。
圖5. P蛋白的缺失抑制了Caco2細(xì)胞向CXCL12刺激方向遷移。A）趨化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。CaCo2細(xì)胞種植在ibidi μ-Slide Chemotaxis3D中間的“1”區(qū)域。B）實(shí)驗(yàn)組的“2”中加含有CXCL12的培液，“3”中加普通培液；對(duì)照組的“2”和“3”中加同樣的培液，之后用ibidi的活細(xì)胞孵育系統(tǒng)連續(xù)觀察細(xì)胞的遷移情況。 B）Ibidi活體孵育系統(tǒng)示意圖。C）ibidi的溫控系統(tǒng)和CO2補(bǔ)充系統(tǒng)保證了細(xì)胞的培養(yǎng)條件可以長(zhǎng)時(shí)期保持穩(wěn)定，孵育小室加熱的頂蓋則保證了鏡下觀察時(shí)不受冷凝水的干擾，成像質(zhì)量?jī)?yōu)異。D）對(duì)照組Caco2細(xì)胞向含有CXCL12的小室方向遷移，而P蛋白敲除的CaCo2細(xì)胞則向兩邊隨機(jī)遷移。E）細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)結(jié)果定量分析。利用WimTaxis Image Analysis軟件進(jìn)行細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡追蹤、分析。
P蛋白影響的另一個(gè)分子VEGF-A與血管生成密切相關(guān)，而血管新生在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過程中都起著至關(guān)重要的作用。P蛋白促進(jìn)成瘤，那么P蛋白是否會(huì)通過促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞分泌VEGF-A，而促進(jìn)腫瘤的血管新生呢？我們采用ibidi研究血管生成的產(chǎn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。ibidiμ-Slide Angiogenesis具有獨(dú)特的雙層孔洞設(shè)計(jì)，在圖6A圖中“黃色”孔洞加入Matrix gel,形成厚度均勻的膠平面，上層孔洞用來加入細(xì)胞培養(yǎng)液（粉色區(qū)域），所需細(xì)胞和試劑用量少。與傳統(tǒng)方法相比較（圖6B），ibidi產(chǎn)品可以輕松形成平整的膠平面，能夠?qū)⒓?xì)胞均勻的鋪在Matrix gel上，方便觀察統(tǒng)計(jì)血管新生形成的分支點(diǎn)、成環(huán)數(shù)量以及細(xì)胞占據(jù)的面積等參數(shù)。而傳統(tǒng)方法往往形成凹形的膠平面，膠表面不平整，細(xì)胞分布不均勻，使得細(xì)胞成像及統(tǒng)計(jì)變得困難。而且ibidi配套開發(fā)的統(tǒng)計(jì)軟件可以解放勞動(dòng)力，只要將間隔采取的圖像上傳，就可以輕松獲得統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖6C）。我們檢測(cè)了野生型CaCo2細(xì)胞及P蛋白敲除的CaCo2細(xì)胞的conditional media對(duì)HUVEC細(xì)胞血管生成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)野生型CaCo2細(xì)胞的conditional media相比P蛋白敲除的CaCo2的conditional media對(duì)HUVEC細(xì)胞tube formation有明顯的促進(jìn)作用（圖6D）。
圖6. Caco2細(xì)胞的conditional media對(duì)HUVEC細(xì)胞血管生成的影響。A）tube formation實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。B）ibidi血管生成產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)：與普通96孔板相比，ibidi 的“μ-Slide Angiogenesis”所需細(xì)胞和試劑量很少，且能讓所有細(xì)胞處于同一光學(xué)平面，提高成像質(zhì)量。C）利用ibidi血管生成產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單，配合軟件分析，輕松獲得血管新生的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。D）HUVEC細(xì)胞種植在ibidi 的μ-Slide Angiogenesis中，加入野生型CaCo2細(xì)胞或P蛋白敲除的CaCo2細(xì)胞的conditional media，觀察細(xì)胞tube formation情況。利用ibidi的活細(xì)胞孵育系統(tǒng)連續(xù)觀察拍攝HUVEC細(xì)胞的tube formation情況，可以看到野生型CaCo2細(xì)胞的conditional media孵育的HUVEC細(xì)胞（upper pannel），相比P蛋白敲除的CaCo2的conditional media孵育的細(xì)胞（lower pannel），其小管形成明顯增多、密度更高。
綜述所述，我們利用易必迪ibidi公司提供的系列產(chǎn)品，借助其優(yōu)異的光學(xué)性能，標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)P蛋白在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其機(jī)理進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)P蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、成瘤等過程中起重要作用，并進(jìn)一步尋找了其下游的作用分子，驗(yàn)證了P蛋白通過CXCR4和VEGF-A在細(xì)胞定向趨化和血管生成中的關(guān)鍵作用。
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